實(shí)驗(yàn)一：肝素 (Heparin)

中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院呂奔教授團(tuán)隊(duì)圍繞膿毒癥的發(fā)病機(jī)理及靶向干預(yù)開展了系列研究，揭示了膿毒癥重要的致病機(jī)制，為膿毒癥的診治提供了潛在的生物標(biāo)志物和藥物干預(yù)靶點(diǎn)，并針對(duì)該靶點(diǎn)進(jìn)行藥物篩選，為今后膿毒癥的防治提供了新的思路。

2021年，呂奔教授研究團(tuán)隊(duì)在Immunity雜志上發(fā)表文章，針對(duì)前序研究中發(fā)現(xiàn)的HMGB1-LPS-caspase-11途徑，篩選出肝素 (Heparin) 能高效并選擇性地抑制Caspase-11活化，并闡明了肝素在膿毒癥中能通過抑制Caspase-11的活化防止臟器損傷、DIC發(fā)生和死亡的機(jī)制。

觀察圖1的動(dòng)力學(xué)表征數(shù)據(jù)可知，肝素與HMGB1有較強(qiáng)結(jié)合，Kd=5.59*10^^-6 M。同時(shí)，通過多濃度梯度進(jìn)樣的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，可以看出LPS+Heparin實(shí)驗(yàn)組相較LPS對(duì)照組，與包被有HMGB1蛋白的芯片的響應(yīng)值 (Response, RU) 顯著降低，即可看出Heparin可以抑制LPS與HMGB1的識(shí)別/結(jié)合。

實(shí)驗(yàn)二：Tuftsin

北京大學(xué)王月丹與初明教授團(tuán)隊(duì)圍繞著新冠病毒的防治工作篩選到了一種天然產(chǎn)物Tuftsin，相關(guān)成果也于2022年發(fā)表在Frontiers in Molecular Biosciences雜志上。Tuftsin是機(jī)體脾臟產(chǎn)生的一段生理活性肽，其基本功能是刺激巨噬細(xì)胞和粒細(xì)胞，提高促吞噬的能力；可以通過增強(qiáng)效應(yīng)細(xì)胞的細(xì)胞毒功能殺傷腫瘤細(xì)胞等，在抗感染方面具有不能替代的作用。

通過多輪的化藥庫(kù)篩選、分子對(duì)接等實(shí)驗(yàn)，課題組篩選到Tuftsin分子。隨后，使用Biacore體外驗(yàn)證了其與ACE2分子及抑制的效應(yīng)分子NRP1的親和力，結(jié)果表明Tuftsin能特異性識(shí)別并結(jié)合ACE2分子。

此外，研究人員通過多濃度梯度進(jìn)樣的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，將S1蛋白固定在CM5芯片上，設(shè)置ACE2 (5 nM) 對(duì)照組及Tuftsin+ACE2（ACE2為固定濃度，5 nM; Tuftsin設(shè)置9/156/625 nM）實(shí)驗(yàn)組；結(jié)果表明，Tuftsin濃度越高，結(jié)合響應(yīng)值 (Response, RU) 越低，即證明Tuftsin可有效阻斷/抑制S1與ACE2的識(shí)別與結(jié)合。

實(shí)驗(yàn)三：黃連素 (Berberine，BBR) 

首都醫(yī)科大學(xué)和北京中醫(yī)藥大學(xué)的科研團(tuán)隊(duì)在傳統(tǒng)中藥中篩選特異性抑制凝血酶的小分子抑制劑，最終得到的黃連素 (Berberine，BBR) 被證明可以直接結(jié)合凝血酶從而抑制其誘導(dǎo)的血小板聚集。凝血酶 (Thrombin) 是血液凝固級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的關(guān)鍵酶，被認(rèn)為是多種心血管疾病中重要的藥物靶點(diǎn)。

研究人員首先在Biacore上證明了Berberine可以直接與凝血酶結(jié)合，兩者的親和力為16.39 μM（圖3 A/B），比已上市的抗凝血藥阿加曲班 (Argatroban) 的親和力更高（圖3 C/D，KD=53.78 μM）。

同時(shí)，研究人員利用Biacore的A-B-A進(jìn)樣設(shè)計(jì)競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)，證明Berberine與Argatroban結(jié)合在Thrombin相同的位點(diǎn)上。A-B-A的進(jìn)樣方式簡(jiǎn)化了競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)的設(shè)置，允許兩種不同的溶液按照溶液A/溶液B/溶液A的順序在同一個(gè)循環(huán)內(nèi)進(jìn)樣，由于競(jìng)爭(zhēng)樣品無需再溶解在運(yùn)行緩沖液里，大大減少了競(jìng)爭(zhēng)樣品的消耗量，非常適用于藥物的競(jìng)爭(zhēng)分析（圖4）。

從圖5的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可以看到：Berberine不存在時(shí)，Argatroban與Thrombin有明顯的結(jié)合信號(hào)（圖5，red line）；而在300 μM Berberine存在的情況下（A-B-A樣品設(shè)置參照?qǐng)D4），Argatroban與Thrombin的結(jié)合響應(yīng)值明顯降低（圖5，blue line）。證明Berberine在Thrombin上的結(jié)合位點(diǎn)與Argatroban是一樣的。綜合后續(xù)的血小板凝集實(shí)驗(yàn)，這一研究說明Berberine是潛在的安全有效的凝血酶抑制藥物。

實(shí)驗(yàn)一：紫草素 (SHK)

NF-κB是一個(gè)可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子家族，調(diào)節(jié)多種生理及病理進(jìn)程。NEMO/IKKβ復(fù)合物則是NF-κB信號(hào)通路中的中心調(diào)節(jié)劑。2022年，大連醫(yī)科大學(xué)馬驍馳、中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所果德安、中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所葉明亮課題組在Signal Transduction and Targeted Therapy雜志上發(fā)表了相關(guān)成果，篩選到NEMO/IKKβ復(fù)合物的潛在抑制劑-紫草素 (SHK) 。

為測(cè)得SHK抑制NEMO/IKKβ復(fù)合物的IC₅₀，課題組做了相關(guān)實(shí)驗(yàn)：把MBP-IKKβ蛋白固定在CM5芯片上，再將GST-NEMO+SHK（GST-NEMO為固定濃度，1 μM; SHK設(shè)置0~3125 nM）的預(yù)混液以多濃度梯度進(jìn)樣的形式流過芯片表面，進(jìn)行結(jié)合信號(hào)的采集，擬合作圖，測(cè)出IC₅₀。

同時(shí)，課題組考慮到實(shí)驗(yàn)的嚴(yán)謹(jǐn)性，將GST-NEMO作為固定相進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)重復(fù)。課題組使用Biacore測(cè)得了紫草素抑制NEMO/IKKβ復(fù)合物的IC₅₀為174 nM，證明其可在體內(nèi)外抑制NF-κB通路，從而減緩結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖，為開發(fā)有效的小分子PPI抑制劑提供一些新的思路。

倫斯勒理工學(xué)院、中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)等單位圍繞著綠茶中的抗氧化劑EGCG展開了豐富的研究，并于2021在NATURE COMMUNICATIONS雜志上發(fā)表相關(guān)成果。文章中闡釋EGCG可與p53分子結(jié)合并阻斷p53與MDM2分子（E3泛素連接酶）的結(jié)合，從而抑制MDM2對(duì)p53的泛素化、穩(wěn)定了p53的抗腫瘤活性。

課題組首先使用Biacore測(cè)定了EGCG與全長(zhǎng)p53、NTD-p53的親和力，探明了EGCG與p53的識(shí)別作用靶點(diǎn)位于p53分子的N末端。同時(shí)，課題組將MDM2分子固定在CM5芯片上，探究了MDM2分子與p53的親和力KD=0.6±0.1 μM。接著使用同一張芯片展開了IC₅₀測(cè)試：將p53+EGCG（p53為固定濃度，250 nM; EGCG設(shè)置0~500 nM）的預(yù)混液以多濃度梯度進(jìn)樣的形式流過芯片表面，進(jìn)行結(jié)合信號(hào)的采集，擬合作圖，測(cè)出IC₅₀=0.2 μM。

小結(jié)