不管是在藥物研發(fā)還是基礎(chǔ)科研中，檢測(cè)蛋白與小分子的相互作用都是一類重要的實(shí)驗(yàn)。小分子最主要的特點(diǎn)是分子量較小，一般在1000 Da以下；并且結(jié)構(gòu)性質(zhì)各異，部分溶解度較差，需要使用有機(jī)溶劑（例如DMSO等）促溶；這些特點(diǎn)給相互作用的檢測(cè)帶來很大的挑戰(zhàn)?；赟PR（表面等離子體共振）原理的Biacore系統(tǒng)具有靈敏度高、可進(jìn)行溶劑校正等優(yōu)勢(shì)，不僅可以檢測(cè)較低的信號(hào)，且對(duì)分子量差異懸殊的互作類型也能精確檢測(cè)，同時(shí)還能消除有機(jī)溶劑帶來的影響，因此越來越多的研究者選擇Biacore進(jìn)行蛋白與小分子相互作用檢測(cè)。

我們將根據(jù)智薈專線收集到的客戶反饋，針對(duì)Biacore系統(tǒng)檢測(cè)蛋白與小分子相互作用實(shí)驗(yàn)中常出現(xiàn)的代表性問題，分上下兩篇進(jìn)行簡(jiǎn)單的分享與討論。本篇為上篇，將主要圍繞實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和樣品準(zhǔn)備方面的問題展開介紹。

一、配體的固定策略以及芯片的選擇

對(duì)于配體（固定相）采用合理的固定方式并達(dá)到所需的固定量，是Biacore實(shí)驗(yàn)邁向成功的第一步。然而所有基于傳感器表面的檢測(cè)技術(shù)，都會(huì)面臨“物質(zhì)遷移效應(yīng)”的影響，所以根據(jù)實(shí)驗(yàn)類型及科學(xué)的偶聯(lián)量計(jì)算公式去控制偶聯(lián)量非常關(guān)鍵。為此，目前僅有Biacore具備這樣嚴(yán)謹(jǐn)?shù)挠?jì)算公式，這其中固定量的計(jì)算方式主要就是參考以下核心方程式，并且其不僅適用于直接偶聯(lián)法的偶聯(lián)量計(jì)算，也可用于捕獲法的捕獲量計(jì)算：

公式中，RL為配體的固定量，Rmax為芯片表面的最大結(jié)合容量，Sm為化學(xué)計(jì)量比（未知情況時(shí)可先設(shè)為1）。此公式可以簡(jiǎn)單理解為，Biacore中產(chǎn)生的響應(yīng)值信號(hào)反映的是芯片表面質(zhì)量的變化。一般情況下，對(duì)于動(dòng)力學(xué)分析，要求Rmax ≤ 50 RU；對(duì)于親和力分析，要求Rmax ≤ 100 RU。由此計(jì)算得到理論固定量RL，在偶聯(lián)法中實(shí)際固定量可能需要1.5~3RL；在捕獲法中，則可以按照理論固定量來設(shè)定配體的捕獲量，因?yàn)椴东@過程的分子朝向固定，條件一般也是溫和的接近中性，最大程度地保留的配體分子的活性。

對(duì)于上面的核心方程式有了基本的了解之后，就可以回答下面這些問題了。

1是選擇固定蛋白還是固定小分子？

首先需要明確的是，如果您的實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖窍氆@得精確的親和力數(shù)值，那建議選擇固定蛋白。考慮到小分子的固定難度、空間位阻以及固定過程對(duì)于結(jié)合的影響等方面的問題，選擇氨基偶聯(lián)的方式固定蛋白往往是最簡(jiǎn)單、有效的固定方式。而小分子本身的活性基團(tuán)有限，基團(tuán)的反應(yīng)活性也與蛋白存在一定的差異，偶聯(lián)條件需要摸索，另外，通過這些基團(tuán)的偶聯(lián)反應(yīng)可能也破壞了小分子僅有的結(jié)合反應(yīng)活性位點(diǎn)。因此，只有對(duì)于某些特定類型的定性實(shí)驗(yàn)，比如分子垂釣，固定小分子也是可行的，通常推薦的固定方式是使用SA芯片固定生物素修飾后的小分子，可以在比較明確的條件下實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的固定，而且生物素分子在一定程度上可以起到間隔臂（spacer arm）的作用，減少小分子結(jié)合受到的空間位阻影響。

綜上所述，固定蛋白的過程相對(duì)簡(jiǎn)單也適用于大多數(shù)結(jié)合反應(yīng)，因此是目前探究蛋白與小分子互作時(shí)最常用的選擇。

2固定蛋白是選擇直接偶聯(lián)還是捕獲法？

先說結(jié)論：我們建議，進(jìn)行蛋白與小分子互作實(shí)驗(yàn)時(shí)優(yōu)先考慮直接偶聯(lián)蛋白的方式。

直接偶聯(lián)（氨基偶聯(lián)）法的操作方法較簡(jiǎn)便、明確，而且可以實(shí)現(xiàn)較高的偶聯(lián)量，在小分子作為分析物時(shí)，有利于獲得比較理想的響應(yīng)值。例如常用的CM5芯片，最高偶聯(lián)量可以到10000 – 15000 RU，非常適合蛋白與小分子此類分子量差異懸殊的檢測(cè)。除了直接偶聯(lián)法以外，根據(jù)樣品性質(zhì)與分子量差異，捕獲法也是一種您可以選擇的固定策略，例如：待固定的樣品未經(jīng)純化，含有其他雜質(zhì)；或者擔(dān)心直接偶聯(lián)的過程會(huì)影響結(jié)合位點(diǎn)等。在這些情況下，可以考慮通過捕獲法固定配體。當(dāng)配體樣品的純度不夠時(shí)，捕獲的過程相當(dāng)于在芯片表面進(jìn)行了一次在線純化；捕獲過程的條件較為溫和，可以盡可能地保留配體的結(jié)合活性，同時(shí)保證配體自由朝向，充分暴露結(jié)合位點(diǎn)。

常用的捕獲類芯片以NTA芯片為例，這是一種可以通過螯合鎳離子捕獲帶有His標(biāo)簽蛋白的捕獲芯片。如下圖1所示，NTA芯片上捕獲量大約在3000 – 4000 RU[1]最為穩(wěn)定，非常適合His標(biāo)簽蛋白與小分子二者分子量差異不是特別大的親和力檢測(cè)。

1. 在NTA芯片上，不同捕獲量水平下基線的穩(wěn)定情況[1]。

3氨基偶聯(lián)蛋白配體是選擇CM5芯片還是CM7芯片？

CM5與CM7芯片表面均為羧甲基化修飾的葡聚糖基質(zhì)，兩者最主要的區(qū)別是CM7芯片的羧基含量顯著高于CM5芯片，因此可以實(shí)現(xiàn)更高的偶聯(lián)量。圖2比較了三對(duì)蛋白與小分子的互作在CM5和CM7芯片上的結(jié)果差異，可以看到同一組互作實(shí)驗(yàn)，在CM7芯片上可以達(dá)到的偶聯(lián)量和分析物響應(yīng)值為CM5芯片的3倍以上 [2] 。

2. 三組蛋白與小分子互作在CM5和CM7芯片上的偶聯(lián)量與分析物響應(yīng)值比較[2]。

如上所述，CM5芯片的最高偶聯(lián)量在10000 – 15000 RU左右，如果按照固定量計(jì)算公式得到的理論偶聯(lián)量遠(yuǎn)超這個(gè)范圍，則可以考慮使用CM7芯片。簡(jiǎn)單來說，當(dāng)?shù)鞍着c小分子的分子量比值大于100時(shí)，就建議考慮換用CM7芯片。

二、樣品準(zhǔn)備的相關(guān)問題

在確定了配體的固定策略，并選定了相應(yīng)的芯片之后，就可以開始下一步的實(shí)驗(yàn)了。進(jìn)入試劑、樣品的準(zhǔn)備階段，又會(huì)遇到哪些問題呢？我們接著往下看。

如何選擇運(yùn)行緩沖液？

目前Cytiva供應(yīng)的用于Biacore實(shí)驗(yàn)的運(yùn)行緩沖液主要有兩大類，分別是基于HEPES緩沖體系的HBS系列緩沖液與基于磷酸鹽緩沖體系的PBS系列緩沖液。

在選擇運(yùn)行緩沖液時(shí)，并沒有明確的規(guī)定必須使用何種緩沖液，應(yīng)該根據(jù)分子互作的自身性質(zhì)選擇合適的緩沖液。一般來說，有以下經(jīng)驗(yàn)可供參考：當(dāng)分析物是小分子的情況下可以首先嘗試PBS 或者PBS-P+緩沖液；而分析物為蛋白時(shí)可以首先嘗試HBS或者HBS-EP+緩沖液。

在一些情況下，小分子的溶解需要一定濃度的有機(jī)溶劑助溶，例如5% DMSO等，而這些有機(jī)溶劑在不同樣品之間的濃度差異會(huì)干擾響應(yīng)值信號(hào)，因此需要對(duì)這部分由運(yùn)行緩沖液造成的信號(hào)進(jìn)行校正——溶劑校正。而有機(jī)溶劑自動(dòng)校正的功能，也是Biacore的絕活兒之一，充分保證了最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果真實(shí)可信。關(guān)于溶劑校正的相關(guān)問題將在下篇中進(jìn)行討論。

需要準(zhǔn)備多少的蛋白用來偶聯(lián)？

實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備的配體蛋白量，至少要足夠其達(dá)到所需的偶聯(lián)量。下表展示了要達(dá)到不同的偶聯(lián)水平時(shí)所需的配體濃度以及相應(yīng)的配體偶聯(lián)時(shí)間（流速為10 μL/min），可供參考[3]。需要注意的是，表中列出的“配體工作濃度”是用偶聯(lián)緩沖液醋酸鈉稀釋配體蛋白樣品后的濃度。為了讓稀釋后的蛋白樣品能夠充分富集在芯片表面，醋酸鈉的稀釋倍數(shù)一般要在20倍以上；如果稀釋倍數(shù)不夠，將影響配體蛋白偶聯(lián)效率。因此，準(zhǔn)備配體蛋白母液時(shí)最好在工作濃度的20倍以上。

表1. 偶聯(lián)量與配體工作濃度參考表[3]。

對(duì)于一個(gè)未知的實(shí)驗(yàn)，摸索合適的偶聯(lián)量等過程是必不可少的，因此對(duì)于蛋白配體的用量也不應(yīng)僅限于夠一次偶聯(lián)實(shí)驗(yàn)使用。一般的建議是，配體蛋白的準(zhǔn)備量在1 mg/mL濃度、50 μL以上。但即便如此，老師們也能清晰的算出來Biacore對(duì)于蛋白的用量非常低，遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于您其他的互作檢測(cè)手段。

小分子分析物的濃度范圍如何確定？

不管在動(dòng)力學(xué)（Kinetics）分析還是在親和力（Affinity）分析中，分析物濃度范圍的確定均與結(jié)合反應(yīng)的解離平衡常數(shù)（KD）有關(guān)。一般設(shè)置的分析物濃度梯度范圍如果能夠覆蓋KD值，將會(huì)達(dá)到較準(zhǔn)確的擬合結(jié)果。在動(dòng)力學(xué)分析中，一個(gè)理想的分析物濃度范圍可以從10 × KD作為最高濃度進(jìn)行梯度稀釋；在親和力分析中，理想的分析物濃度范圍可以選擇從2 × KD的濃度作為最高濃度進(jìn)行梯度稀釋[4]。對(duì)于蛋白與小分子的互作，大多數(shù)情況下是“快結(jié)合快解離”的模式，適用于親和力分析的模型（關(guān)于數(shù)據(jù)分析中模型選擇的問題，將會(huì)在下篇中進(jìn)行討論）。蛋白與小分子結(jié)合反應(yīng)的KD值，基本都在μM級(jí)別，因此可以將小分子最高濃度設(shè)為1000 μM，按照3倍甚至5倍的稀釋比例來配制濃度梯度（拉大范圍）。進(jìn)行這樣的初步實(shí)驗(yàn)后，基本可以確定反應(yīng)KD值的大致范圍，后續(xù)可以調(diào)整濃度范圍、減小稀釋比例再進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。當(dāng)然，小分子能夠達(dá)到的最高濃度還受到溶解度等因素的影響。

以上是針對(duì)Biacore檢測(cè)蛋白與小分子互作的實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)以及樣品準(zhǔn)備方面的常見問題分享。良好的開端是成功的一半，合理的活性配體偶聯(lián)量、分析物濃度范圍以及運(yùn)行緩沖液選擇，將幫助我們得到更理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在下篇中我們將繼續(xù)分享關(guān)于實(shí)驗(yàn)進(jìn)行以及數(shù)據(jù)分析方面的常見問題，敬請(qǐng)期待！

文章來源：https://mp.weixin.qq.com/s/sG_kZkA5Kcdory0KPagPgw