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超微量分光光度計是核酸和蛋白定量的常用工具,在日常使用過程中,空白測量是在樣品測量前所必須的步驟。正確的理解什么是NanoPhotometer?或任何其他超微量分光光度計上的空白測量,以及空白讀數(shù)對工作流程和結果產(chǎn)生的影響,是保障儀器正確操作和獲得可靠結果的基礎。
對于雙光束紫外-可見分光光度計而言,空白與樣品測量在空間上分開,扣除空白后得到樣品的吸光值。而超微量分光光度計通常采用單光束設計,空白與樣品測量需要在時間上分開,在進行空白測量后,得到表征光源強度的基線,然后樣品的測量值扣除空白測量值得到樣品的吸光值。在實際測量過程中,在一次空白測量之后,只要樣品的溶劑成分不變,可以連續(xù)地測量多個樣品,結果的計算都基于初始空白值的扣除。然而,空白基線的穩(wěn)定是否受時間影響呢?即多久做一次空白,可以確定樣品的吸光值和濃度準確可靠呢?
由于超微量分光光度計通常使用氙閃燈光源,作為一種閃爍點亮的冷光源,其穩(wěn)定性是非常好的,基線的穩(wěn)定性通常在1小時內(nèi)可保持在0.002-0.003A(10mm光程)之內(nèi)的波動水平,如果將光程因子計算在內(nèi),相當于1-2ng/μl dsDNA的濃度水平。對于常規(guī)濃度的樣品而言,這個誤差的引入幾乎可以忽略,也不會反映在重復性之上。因此,對于一般性實驗,在起碼一小時內(nèi),空白測量是不用重新進行的(在樣品臺清潔的情況下)。而對于低濃度樣品和一些流程嚴格控制的實驗而言,基線隨時間的波動將引入值得關注的測量不確定度,可能產(chǎn)生可觀的示值誤差,但對重復性的影響較小。因此,對于一些特殊樣品,空白測量與樣品測量不宜間隔較長的時間,以減小風險,甚至可能每個樣品都重新做空白。
NanoPhotometer?在每次開機時都會對光源強度進行檢測,初始化通過即代表光源已進入工作狀態(tài)。在使用過程中,也可以通過光譜診斷功能,實時地進行光源性能檢查。空白測量和基線穩(wěn)定性對于超微量而言是重要的,不少日常使用中出現(xiàn)的問題都源自于空白和基線漂移。除了設備自身的診斷功能之外,定期的進行設備的基線穩(wěn)定性檢查也有助于判斷和基線有關的部件是否正常,如光源、光學路徑和檢測器。
Implen通過樣品壓縮法實現(xiàn)了測量時間的大幅縮短,使光源的壽命延長至10年以上,在這個基礎上,進一步增強了光線的強度控制和穩(wěn)定性。而出色的光學路徑設計和高性能通光材料的使用,也確定了基線波動在很小的范圍內(nèi)。在實際使用過程中,用戶根據(jù)樣品的實際情況和實驗允差要求,制定合理的空白測量頻率,可在確定可靠性的同時提高實驗效率。