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在日常的微量核酸與蛋白質(zhì)定量中，大家都會(huì)或多或少的遇到測(cè)量不準(zhǔn)確的問(wèn)題。這有時(shí)來(lái)源于主觀的判斷，也可能因?yàn)榕c其他方法的對(duì)比。樣品的定量結(jié)果與預(yù)期值出現(xiàn)一定偏差有時(shí)是正常的事情，可能是因?yàn)椴煌瑴y(cè)量方法本身存在的差異，如使用Nano儀器與Qubit的結(jié)果對(duì)比，即NQ比（具體可參考“每天都提核酸，聽說(shuō)過(guò)NQ比嗎？”），或者使用紫外法對(duì)比HPLC的結(jié)果。而對(duì)于單純的使用微量樣品進(jìn)行基于紫外法的定量，如果出現(xiàn)很大的偏差，則可能是由于設(shè)備、樣品狀態(tài)和上樣操作等多種因素造成的，應(yīng)當(dāng)引起重視。
根據(jù)Implen對(duì)來(lái)自全球的超微量用戶的長(zhǎng)期追蹤與統(tǒng)計(jì)，我們總結(jié)出了可能的四種大概率原因，希望大家在設(shè)備使用的過(guò)程中多加注意，輕松的使用超微量設(shè)備獲得可靠的結(jié)果。
光程漂移
超微量設(shè)備由于光程漂移而產(chǎn)生誤差的可能性占比為35%，是第一大可能因素。設(shè)備在使用一段時(shí)間后出現(xiàn)的性能下降，可能是相對(duì)普遍的，而對(duì)于超微量設(shè)備，較大的變數(shù)就在于光程系統(tǒng)的準(zhǔn)確與漂移。各個(gè)品牌都會(huì)采用精密的光程設(shè)計(jì)，精確到微米級(jí)別，但隨著設(shè)備的使用，細(xì)小的部件磨損或漂移也可能導(dǎo)致光程的偏差，進(jìn)一步表現(xiàn)為測(cè)量結(jié)果的偏差。且這種偏差將會(huì)被放大，這是由于設(shè)備的光程虛擬稀釋倍數(shù)造成的 – 吸光值測(cè)量結(jié)果需要乘以光程倍數(shù)，而同時(shí)誤差也將被放大同樣的倍數(shù)。
不同的設(shè)備可能有不同的光程切換設(shè)計(jì)，一些結(jié)構(gòu)在切換的過(guò)程中將會(huì)產(chǎn)生機(jī)械切割，需要通過(guò)維護(hù)和光程校準(zhǔn)，修復(fù)偏差，可參考廠家的說(shuō)明書或維護(hù)指南。Implen所采用的真實(shí)光程技術(shù)：即錨定光程切換技術(shù)，采用電磁彈片的切換方式，在兩個(gè)精確定義的光程間切換，無(wú)中間位置，可確保光程的準(zhǔn)確性，而無(wú)需進(jìn)行維護(hù)和光程校準(zhǔn)。
混勻問(wèn)題&濁度
樣品的均質(zhì)性是濃度測(cè)量的前提，由于混勻或濁度的問(wèn)題導(dǎo)致的測(cè)量誤差，可能性占比達(dá)30%。以正確的方式混勻樣品，是測(cè)量前的必要步驟，可通過(guò)渦旋、離心、震蕩、彈撥樣品管等多種方式實(shí)現(xiàn)。一些特殊樣品，槍頭取樣的位置不同也可能導(dǎo)致測(cè)量結(jié)果不同，如易產(chǎn)生濃度梯度或易沉降的樣品。一些樣品中具有一定的濁度，雖然可通過(guò)背景校正進(jìn)行修正，但仍不能排除由此導(dǎo)致的測(cè)量誤差，濃度測(cè)值通常會(huì)偏高，需要進(jìn)行具體評(píng)估。在嚴(yán)格的場(chǎng)合下，可通過(guò)雙波長(zhǎng)或多元散射校正的方式進(jìn)行修正。NanoPhotometer?具有濁度警告功能，可提示用戶較差的樣品質(zhì)量和潛在問(wèn)題。
樣品&上樣問(wèn)題
有時(shí)樣品本身是存在問(wèn)題的，和上樣問(wèn)題一起達(dá)到了20%的誤差可能性占比。如一些溶解在高鹽緩沖液或在待測(cè)波長(zhǎng)處具有吸收的緩沖液中的樣品。在空白測(cè)量的時(shí)候，實(shí)際上引入了空白基線的不確定度，樣品測(cè)值時(shí)可能會(huì)不穩(wěn)定，甚至?xí)霈F(xiàn)負(fù)數(shù)。因此，樣品成分要具備方法學(xué)適用性。如果確實(shí)存在一些具有共同吸收的成分，則需要具體評(píng)估結(jié)果的可靠性，或降低置信預(yù)期。
一些錯(cuò)誤的操作習(xí)慣，尤其是上樣手法，將影響測(cè)量結(jié)果。如習(xí)慣使用槍頭涂抹樣品，這將導(dǎo)致樣品過(guò)于平鋪在樣品臺(tái)上，實(shí)際用于檢測(cè)的樣品量可能減少，無(wú)法形成液柱，或不滿足實(shí)際樣品體積。一些容易有氣泡的樣品，如溶解在甘油中的蛋白質(zhì)樣品，移液時(shí)應(yīng)避免吸入氣泡。黏度較高的樣品可利用反向移液，避免吹出氣泡。
樣品蒸發(fā)
在一些場(chǎng)景下，樣品蒸發(fā)的問(wèn)題將產(chǎn)生可觀的偏差。如設(shè)備放置在空調(diào)出風(fēng)口，樣品液柱不可避免的產(chǎn)生蒸發(fā)，將得到偏高的檢測(cè)結(jié)果（但純度比值通常不會(huì)改變）。一些設(shè)備如需在層流或生物安全柜中使用，將影響更大。因此，設(shè)備的放置位置需要遵循廠家的手冊(cè)，避免這些外部因素影響（包括震動(dòng)）。采用樣品壓縮法的Implen產(chǎn)品，采用封閉的檢測(cè)環(huán)境，可避免測(cè)量過(guò)程中蒸發(fā)的影響，更可適用于微量樣品動(dòng)力學(xué)分析等應(yīng)用。對(duì)于一些含有有機(jī)溶劑成分的樣品，蒸發(fā)的影響更加可觀，一些因素共同作用，可能導(dǎo)致很大的偏差。
以上四類原因是導(dǎo)致微量分光光度計(jì)產(chǎn)生測(cè)量誤差的常見可能因素，有時(shí)候可能是多種因素共同作用導(dǎo)致測(cè)量偏差較大，充分了解設(shè)備的原理、操作方法和樣品狀況，有助于獲得更加可靠的數(shù)據(jù)。找出原因，對(duì)癥下藥，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)過(guò)程，更加輕松、省心的進(jìn)行測(cè)量。關(guān)于超微量的任何問(wèn)題，您都可以咨詢德國(guó)IMPLEN。
