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    親和層析純化蛋白質(zhì)常見問題解析

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    親和層析主要依靠蛋白質(zhì)與介質(zhì)配體間特異性的可逆結(jié)合作用進(jìn)行分離。配體可直接與目標(biāo)蛋白質(zhì)結(jié)合,也可以與蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合的標(biāo)簽結(jié)合。親和層析通常是一種最粗放的純化過程,一般在純化工藝的前期應(yīng)用,可將目標(biāo)物質(zhì)快速的從樣本中捕獲出來,基于后續(xù)應(yīng)用的要求,可能只需要一步親和層析即可獲得純度合格的蛋白質(zhì)。

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    蛋白質(zhì)和親和介質(zhì)不結(jié)合

    Q:

    標(biāo)簽未翻譯或標(biāo)簽被包裹在結(jié)構(gòu)內(nèi)部


    A:

    檢查質(zhì)粒序列或?qū)?biāo)簽移到其他位置,標(biāo)簽移到其它位置扔被包裹在結(jié)構(gòu)內(nèi)部時(shí),就要將標(biāo)簽暴露出來(如用尿素變性,但尿素變性性只有部分標(biāo)簽蛋白可以和親和填料結(jié)合如His標(biāo)簽蛋白和金屬螯合填料,但GST標(biāo)簽和GST填料就不能在親和結(jié)合)



    Q:

    結(jié)合緩沖液不合適及層析柱沒平衡好


    A:

    調(diào)整緩沖液,如金屬螯合介質(zhì)和His標(biāo)簽蛋白結(jié)合時(shí)pH應(yīng)在7.3-8.5之間,在如肝素親和介質(zhì)和DNA聚合酶結(jié)合時(shí)鹽濃度太高影響結(jié)合,應(yīng)控制在50mM以下。層析柱沒平衡好,柱床體系中的環(huán)境如pH,離子強(qiáng)度也會(huì)影響結(jié)合,層析上樣前要充分的平衡層析柱。



    Q:

    結(jié)合時(shí)間不夠


    A:

    降低上樣流速讓蛋白和介質(zhì)有充分的接觸時(shí)間。



    Q:

    層析介質(zhì)選的不合適


    A:

    親和介質(zhì)分類,一類是特異性結(jié)合一種蛋白,另一類是特異性結(jié)合一類蛋白。如蛋白a介質(zhì)結(jié)合一種蛋白,而肝素介質(zhì)結(jié)合一類蛋白。所以選擇的時(shí)侯我們一定要了解其原理。



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    蛋白結(jié)合在柱子未洗脫出

    Q:

    蛋白和介質(zhì)結(jié)合力過強(qiáng)


    A:

    增加洗脫強(qiáng)度,比如his蛋白和鎳柱結(jié)合,可以增加取代基咪唑的濃度。



    Q:

    蛋白聚集在層析柱上


    A:

    通過調(diào)整層析過程的緩沖液增加蛋白的穩(wěn)定性,改善蛋白在層析柱上的狀態(tài)。聚集在層析柱上時(shí)就要對(duì)層析柱進(jìn)行CIP清洗。



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    低分辨率(洗脫后純度低)

    Q:

    層析過程流速的影響


    A:

    調(diào)整層析過程的流速,流速影響蛋白質(zhì)和介質(zhì)的親和力,層析時(shí)要選擇合適的流速。



    Q:

    柱床未充分淋洗


    A:

    上樣后,要對(duì)柱床進(jìn)行充分的淋洗,將未和介質(zhì)結(jié)合的留在介質(zhì)顆粒間隙,孔內(nèi)的蛋白洗出來,在洗脫。



    Q:

    蛋白之間的非特性結(jié)合


    A:

    優(yōu)化體系緩沖液,比如加入10%的甘油等減少蛋白之間的非特異性結(jié)合。



    Q:

    介質(zhì)的非特異性結(jié)合


    A:

    優(yōu)化緩沖液,減少層析過程的非特異性結(jié)合,如His蛋白用金屬螯合填料純化時(shí),可以在緩沖液中加入300mM的氯化鈉,減少蛋白和介質(zhì)的非特異性結(jié)合。



    Q:

    洗脫過程的影響


    A:

    如肝素柱子洗脫過程中拉合適的鹽梯度可以提高特異性,His標(biāo)簽蛋白和金屬螯合介質(zhì)結(jié)合后,洗脫時(shí)拉咪唑梯度可以提高純度。



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    蛋白質(zhì)純化過程中失活

    Q:

    蛋白去折疊或聚集


    A:

    優(yōu)化緩沖液使其利于蛋白質(zhì)保持穩(wěn)定。蛋白質(zhì)在介質(zhì)上的高密度下容易聚集可以添加一些蛋白的增溶劑等。



    Q:

    純化過程中保持蛋白的活性的輔助因子被去除


    A:

    如一些酶類的活性需要金屬離子輔助其活性,在純化過程中就要添加蛋白的活性輔助因子。



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